„Przyczyną niepowodzeń wymienionych zabiegów jest lokalizacja w naczyniach obwodowych tzw. okluzji powodowanych przez miażdżycę oraz nakładającą się zakrzepicę — tłumaczy prof. Jan Skóra z Katedry Chirurgii Naczyniowej, Ogólnej i Transplantacyjnej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. — Leczenie zachowawcze obejmujące infuzje płynów, heparynoterapię, podawanie prostawazyny, leków: fibrynolitycznych, antyagregacyjnych, naczyniorozszerzających czy reologicznie czynnych często nie wpływa na dostateczną poprawę perfuzji mikrokrążenia. Obwodowa lokalizacja zmian uniemożliwia zastosowanie właściwej terapii chirurgicznej, w wyniku czego następuje utrata kończyny i inwalidztwo” — wyjaśnia profesor. 

Nowatorskie wykorzystanie komórek macierzystych i genów

W poszukiwaniu nowych sposobów rewaskularyzacji niedokrwionych tkanek specjaliści z wrocławskiej kliniki zwrócili uwagę na stałe występowanie procesu neoangiogenezy w organizmie. 

„Za pomocą stymulacji ustroju do formowania nowych naczyń można zabezpieczyć odpowiednie ukrwienie tkanek, zapewnić im nowe naczynia w miejsce trwale niedrożnych. Kombinowana (hybrydowa) terapia krytycznego niedokrwienia kończyn dolnych z użyciem komórek macierzystych i genów stanowi szansę na uratowanie kończyn i poprawienie komfortu życia chorych” — mówi prof. dr hab. n. med. Artur Pupka, kierownik Zakładu Chirurgii Endowaskularnej Katedry Chirurgii Naczyniowej, Ogólnej i Transplantacyjnej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. 

Leczenie hybrydowe krytycznego niedokrwienia kończyn dolnych z wykorzystaniem komórek macierzystych szpiku CD34 i terapii genowej z wykorzystaniem plazmidu VEGF165 — bo tak brzmi pełna nazwa terapii — jest nowatorskim sposobem postępowania, stosowanym w niewielu ośrodkach na świecie, a w Polsce tylko we wrocławskiej klinice.

Szczegółowe kryteria kwalifikacji chorych

Wrocławscy specjaliści już w 2004 roku rozpoczęli leczenie krytycznego niedokrwienia kończyn metodami alternatywnymi wobec klasycznych: za pomocą terapii genowej, a następnie implantacji komórek macierzystych pochodzących z własnego szpiku chorego, a także kombinacji tych metod. 

Do procedury kwalifikowano chorych zagrożonych utratą kończyny, z krytycznym niedokrwieniem kończyn dolnych na tle zmian miażdżycowych, u których od minimum 12 tygodni występował ból spoczynkowy nocny i/lub niedokrwienne owrzodzenie albo martwica kończyny dolnej, a konwencjonalne leczenie nie przynosiło poprawy i brak było możliwości wykonania zabiegu rewaskularyzacyjnego. 

Chorzy musieli spełniać jeszcze dwa warunki: w badaniu angiograficznym stwierdzany był u nich obwodowy typ niedrożności oraz w dwóch niezależnych badaniach wykonanych w odstępie 7 dni przed włączeniem do próby wartość współczynnika kostka/ramię musiała być mniejsza niż 0,5.

Metody przygotowania koncentratu komórkowego

„Po poinformowaniu chorego o istocie badania i uzyskaniu świadomej zgody uczestnictwa pobieraliśmy szpik metodą wielokrotnych nakłuć talerzy kości biodrowych z zastosowaniem znieczulenia ogólnego — opowiada prof. Pupka. — W celu uniknięcia wykrzepiania szpiku stosowano preparat do konserwacji krwi ACD-A w proporcji 1:10 ml pobranego szpiku. Szpik pobrany do worka kolekcyjnego, przed dalszymi etapami opracowania filtrowano z zastosowaniem filtrów grawitacyjnych o wielkości porów 500 i 200 mikronów (zawartych w zestawie). 

Komórki jednojądrzaste izolowano ze szpiku z zastosowaniem automatycznego separatora komórkowego Fenwall CS 3000 plus (Baxter, Stany Zjednoczone), zgodnie z zaleceniami producenta. Aferezat komórek jednojądrzastych zawieszano w objętości 100-150 ml autologicznego osocza, pobierano 1 ml w celu oznaczenia leukocytozy oraz liczby komórek CD34+ otrzymanego koncentratu komórkowego. Końcowy produkt filtrowano za pomocą filtru do produktów krwiopochodnych o wielkości porów 50 mikronów. 

Otrzymane komórki szpikowe były inkubowane przez 2 godziny z plazmidem genu VEGF165. Przed podaniem preparatu pacjentom pobierano posiewy materiału w celu kontroli jego jałowości. Liczbę komórek jednojądrzastych oznaczano z zastosowaniem cytometru przepływowego. Do kliniki dostarczano koncentrat zawierający komórki progenitorowe (w którym określano jedynie obecność frakcji komórek CD32+, bez ACC133+) oraz morfologię preparatu, próbkę w celu oznaczeń (do zamrażania) i przeprowadzania posiewów”. 

Implantacja preparatu i obserwacja pooperacyjna

58 godzin od pobrania szpiku wykonywano implantację preparatu. „Podawano go dwiema drogami: domięśniowo — w wyznaczane wcześniej okolice niedokrwione i na granice strefy zadowalająco i niedostatecznie ukrwionej, zwykle 4-12 wkłuć: 2-4 w udo, a 2-7 w podudzie; dotętniczo — podczas kolejnej angiografii (do 24 godz. od pobrania szpiku) w końcowym odcinku drożnym osiowego naczynia tętniczego kończyny niedokrwionej (30-50 ml). Zawsze wykonywano posiewy z preparatu szpiku, każdorazowo były jałowe. Codziennie, do momentu wypisania pacjenta ze szpitala, kontrolowano parametry ogólne (RR, tętno, częstość oddechów, temperatura)” — opowiada prof. Pupka. 

Dodatkowo w obserwacji uwzględniano: wartość współczynnika kostka/ramię (ABI) (przed leczeniem, po 1., 3. i 6. miesiącu terapii); makroskopowy obraz ewentualnych owrzodzeń (fotografie); odczucia pacjentów oceniane za pomocą skali wizualno-analogowej (VAS), skali jakości życia według klasyfikacji WHO (przed leczeniem, w 1., 3. i 6. miesiącu leczenia). Dane te zbierano w formie pisemnej jako ankietę wypełnianą samodzielnie przez chorego.

Punktami końcowymi obserwacji były amputacje i śmierć pacjenta. W przypadku amputacji pobierano preparat do badania histologicznego.

Procedura bezpieczna, którą warto doskonalić

Implantacja pozyskanych ze szpiku komórek progenitorowych inkubowanych genem VEGF drogą wstrzyknięć domięśniowych i dotętniczych jest procedurą bezpieczną dla chorego. „Wydaje się, że podanie komórek macierzystych i genu pozwala przyspieszyć rewaskularyzację krytycznie niedokrwionej kończyny i ostatecznie zmniejszyć odsetek amputacji, a także uzyskać zagojenie niedokrwiennych zmian skórnych — ocenia chirurg naczyniowy. — Technika stymulacji angiogenezy poprzez działanie bodźcowe polegające na podaniu progenitorów w niedokrwioną okolicę rokuje nadzieje ze względu na możliwość udoskonalenia metody przynajmniej na dwa sposoby. Pierwszym jest inkubacja z VEGF, a drugim kontrola preparatu uzyskanego ze szpiku w kierunku liczby komórek o istotnym działaniu progenitorowym (ACC+133). Terapia hybrydowa stosowana w naszym ośrodku pozwala na uratowanie krytycznie niedokrwionych kończyn w przypadkach nie podlegających leczeniu operacyjnemu” — mówi specjalista. 

Nie odnotowano poważnych powikłań dotyczących znieczulenia ogólnego ani pobrania szpiku, podania zawiesiny komórek szpiku czy też angiografii. Materiał zawsze był jałowy i nie wykryto powikłań septycznych. Rezultaty leczenia z zastosowaniem frakcji komórkowej własnego szpiku w połączeniu z terapią genową pozwalają więc na optymistyczną ocenę tej metody. „Obserwowaliśmy poprawę subiektywną, zmniejszenie odczucia bólu i zwiększoną sprawność chorych. Znamienne było gojenie się owrzodzeń i ran po wykonywanych nefrektomiach, a także mniejszy odsetek amputacji. Wydaje się, że terapia hybrydowa (komórki macierzyste i gen) stanowi jedyną metodę leczenia w przypadkach niepoddających się leczeniu operacyjnemu, choć jej dalszy rozwój wymaga dalszych badań” — ocenia prof. Jan Skóra.